Recupero ad ampio spettro della secrezione di glicoproteine T-dark mutanti

Per svolgere la propria funzione, tutte le proteine devono acquisire una forma ben specifica. Negli esseri viventi esiste in ogni cellula una macchina molto efficiente che trattiene qualsiasi proteina che non abbia completato la maturazione, rilasciandola soltanto quando ha raggiunto la forma e funzione corretta. Questo sistema di controllo di qualità è molto utile nelle persone sane; alcuni individui, però, nascono con delle mutazioni nel DNA che provocano un difetto in una proteina senza tuttavia abolirne totalmente la funzionalità. Se questo rigido controllo di qualità trattiene all’interno della cellula delle proteine difettose non mature possono esserci conseguenze gravi per l’organismo. In questo progetto studieremo dieci proteine difettose, scelte tra circa 6.000 proteine umane di cui si sa molto poco o addirittura nulla (“Proteine T-dark”). La nostra ipotesi è che rendendo il controllo di qualità meno severo, la proteina difettosa e la sua attività possano essere in parte recuperate. Seguiremo la traiettoria cellulare di tali proteine difettose in cellule private del sistema di controllo qualità e verificheremo se alcune saranno in grado di arrivare correttamente a destinazione. Se la nostra ipotesi fosse confermata, fornirebbe il razionale per un approccio farmacologico in grado di rendere il controllore della qualità più tollerante ai difetti di proteine mutate. I nostri risultati porranno le basi per una possibile terapia di una vasta gamma di malattie rare, accomunate dal fatto di essere provocate dall’estrema efficienza del controllo di qualità quando la proteina difettosa del paziente è ancora attiva.

Dalla prima struttura cryo-EM del checkpoint di ERAD ai suoi inibitori: verso nuovi farmaci chemioterapici antitumorali

La degradazione associata al reticolo endoplasmatico (RE) è una strategia fondamentale della cellula eucariotica che le consente di degradare tutte le glicoproteine che non riescono a ripiegarsi correttamente, per evitare che un accumulo di glicoproteine mal ripiegate intasi il RE. La degradazione associata al reticolo endoplasmatico (ERAD) è avviata dal suo enzima di controllo, la mannosidasi di degradazione del reticolo endoplasmatico (EDEM), che è in grado di riconoscere qualsiasi glicoproteina mal ripiegata in modo terminale e di segnalarla per la degradazione. L’obiettivo specifico di questo progetto è identificare piccoli ligandi molecolari di HsEDEM3 che si leghino ai siti catalitici e/o allosterici e saggiare il loro potere inibitorio nella cellula. Questi ligandi costituiranno i punti di partenza per una futura chimica medicinale volta a sviluppare inibitori specifici per HsEDEM3. Attraverso lo screening Fragment Based Lead Discovery, ci proponiamo di identificare frammenti che si legano al sito catalitico di HsEDEM3 e composti che possono interferire con l’interazione del dominio catalitico con i domini C-terminali della stessa proteina. Il potenziale risultato a lungo termine di questo lavoro sarebbe un inibitore allosterico o un inibitore del sito catalitico di HsEDEM3 da usare in studi antivirali, antitumorali o per la terapia di alcune malattie rare. I nostri obiettivi sono: A: clonazione, espressione e purificazione di costrutti solubili del dominio catalitico GH47 dell’EDEM3 umana; B: cristallizzazione dei costrutti solubili del dominio catalitico GH47  dell’EDEM3 umana ottenuti al punto 1; C: Scoperta di ligandi dei costrutti solubili del dominio catalitico GH47 di EDEM3 umana (tramite Fragment-Based Lead Discovery con i cristalli ottenuti in 2.); D: Saggi di inibizione cellulare e in vitro di HsEDEM3 umano per verificare se i frammenti di ligandi di EDEM GH47 ottenuti in 3. sono inibitori di EDEM3

Ruolo dell’attività ossidoriduttiva del checkpoint di ERAD (EDEM:PDI) nell’invecchiamento

In un modello di Drosophila, è stato riscontrato che la promozione della degradazione associata all’ER (ERAD) attraverso l’aumento dei livelli di proteine α-mannosidasi-simili (EDEM) che condannano glycoproteine misfoldate a ERAD fornisce protezione contro la proteinopatia cronica dell’ER senza causare alcuna tossicità (10.1016/j.devcel.2017.05.019). Questo effetto protettivo è stato osservato senza influenzare la rete di espressione genica UPR. È interessante notare che in questi moscerini, con l’invecchiamento del cervello, l’attività ERAD è diminuita, ma l’upregolazione degli EDEM ha contrastato il declino comportamentale legato all’età e ha prolungato la durata della vita. In particolare, l’attività mannosidasica delle EDEM non era necessaria per questi effetti protettivi. Di conseguenza, il potenziamento della funzione degli EDEM nell’ERAD è promettente come potenziale bersaglio terapeutico per le malattie croniche. La nostra recente struttura Cryo-EM di un complesso EDEM:PDI suggerisce che l’attività redox del complesso è importante per la sua funzione: le glicoproteine clienti possono essere reclutate al complesso tramite disolfuri misti alla PDI. Utilizzeremo chimica delle proteine e biologia strutturale per confermare l’importanza dell’attività redox del checkpoint di misfolding ERAD, che a sua volta può spiegare il ruolo osservato di EDEM nell’invecchiamento, indipendentemente dalla sua attività di mannosidasi.

IN-FACT One Health Basic and Translational Actions Addressing Unmet Needs on Emerging Infectious Diseases

Il programma di ricerca INF-ACT si occupa delle malattie infettive emergenti nell’uomo sia dal punto di vista fondamentale che da quello traslazionale, tenendo conto della salute umana con un approccio “One Health”, includendo animali domestici e selvatici come potenziali serbatoi di malattie e fattori ambientali che aumentano la possibilità di contagio.

Il progetto è focalizzato su tre Nodi di Ricerca “verticali”

• Minacce virali emergenti e ri-emergenti (virus respiratori e zoonosi);
• Vettori artropodi e patogeni trasmessi da vettori (malattie trasmesse da vettori con maggiore rischio di diffusione a livello emergenziale in Italia, quali le arbovirosi);
• Malattie causate da batteri e funghi resistenti a molteplici antibiotici (AMR e meccanismi molecolari di multi-resistenza agli antibiotici).

e due Nodi di Ricerca “trasversali”

• Epidemiologia integrata in chiave “One Health” (uomo, animale e ambiente), monitoraggio e modelli matematici;
• Sviluppo di nuove strategie terapeutiche (identificazione di bersagli molecolari, librerie di molecole per approcci di drug discovery, test di possibili candidati efficaci e loro ottimizzazione).

Il Consorzio INF-ACT consta di 25 istituzioni di ricerca pubbliche e private distribuite su tutto il territorio nazionale; il CNR è coinvolto nei Node 1, 3, 4 e 5.

Struttura e funzione di EDEM: PDI, il controllore della degradazione associata al reticolo

Il calore e la siccità stressano le piante. Un ruolo importante nella resistenza a questo stress è svolto da un enzima chiamato Endoplasmic Reticulum Degradation Enhancing Mannosidase (“EDEM”). Questo enzima esiste in una forma resistente al calore in un fungo termofilo originariamente scoperto in un mucchio di letame di cavallo che fermentava al sole a circa 60-65 °C. La prima parte del progetto è volta a testare la resistenza allo stress di piante che esprimano quella EDEM di fungo termoresistente. Tale pianta transgenica potrebbe essere utile per estrarre metalli pesanti e/o indurre la degradazione di composti organici in terreni contaminati (fitorisanamento) oppure in agricoltura per avere aumentata produttività agricola in condizioni ostili (stress da caldo o da carenza di acqua durante fioritura e impollinazione). La seconda parte del progetto ambisce a ottenere un modello 3D di EDEM – per cristallografia a raggi X e/o criomicroscopia elettronica di trasmissione. Questo modello aiuterà a capire come funzioni EDEM e a progettare molecole per modularne l’attività catalitica. Oltre alla struttura, l’attività dell’enzima sarà caratterizzata in vitro, in cellula e in planta.

Determinazione della struttura del corpo proteico del mais, la gabbia del cibo

Il seme della pianta di granturco (Zea mays, detto anche mais) contiene zeine, proteine di stoccaggio del seme situate nel lume del Reticolo Endoplasmatico (ER) delle sue cellule. La principale proteina di stoccaggio del seme di mais, la Zea mays 27g-zeina (Zm27g-zeina), polimerizza nell’ER del seme di mais per formare grandi gabbie – che poi accumulano al loro interno altre proteine di stoccaggio del seme di mais, fornendo così un’impalcatura strutturale al corpo proteico (CP) che è la principale fonte di cibo del seme. L’N-terminus di Zm27g-zeina è necessario per la polimerizzazione che forma la gabbia PB – e il C-terminus della proteina si folda come un dominio di 2S-albumina – ma non sono disponibili strutture per l’intera proteina né per uno dei due domini separatamente. I modo in cui la Zm27g-zeina dà origine alla struttura molecolare della gabbia del CP è del tutto sconosciuto, comprese questioni quali la coesistenza intermolecolare Zm27g-zeina: interazioni covalenti e non covalenti tra monomeri di Zm27g-zeina  formano la gabbia del CP; ci sono pori nella gabbia del CP e, in caso affermativo, di quali dimensioni; o l’orientamento relativo dei termini N- e C- nel contesto della gabbia del CP completamente formata (i termini N-/C- di Zm27g-zeina sono all’interno del CP, o all’esterno, o entrambi? ). Queste domande sulla gabbia di Zm27g-zeina del CP sono molto importanti per le applicazioni nei campi della scienza alimentare, dell’espressione di proteine ricombinanti, della farmacologia e delle nanotecnologie. Risponderemo a queste domande utilizzando la microscopia confocale, la cristallografia a raggi X e la crio-EM.

Sviluppo di una piattaforma per biologia strutturale nella rete di infrastrutture di ricerca europee IBISBA

La funzione delle proteine può essere compresa attraverso la loro struttura. La struttura di una proteina può aiutare la progettazione di modifiche che comportano un aumento o una riduzione dell’attività, a seconda dell’obiettivo desiderato. La progettazione di proteine sintetiche ha bisogno sia di una convalida attraverso la determinazione della struttura, sia di essere ispirata dalle strutture delle proteine – sia quelle da modificare sia i prodotti delle fasi iniziali della progettazione.  Il servizio che stiamo sviluppando è una piattaforma che implementi il processo di determinazione della struttura (dal gene alla struttura della proteina). L’utente fornirà il gene che codifica la proteina di interesse, o il sistema di vettori/espressione e il protocollo di purificazione per produrla ricombinatamente, o la proteina purificata.  Il servizio fornirà uno dei seguenti risultati:

• – Struttura cristallina.
• – Struttura Cryo-EM (per target con peso molecolare MW superiore a 200 kDa).